物质科学

Physical science

    近日，清华大学精密仪器系尤政教授课题组提出了一种基于点阵激光激发的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。相关成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”为题，以封面文章的形式发表在Cell Press细胞出版社旗下期刊Device上。第一完成单位为清华大学精密仪器系。中国工程院院士、清华大学精密仪器系教授尤政，斯坦福大学研究科学家赵精晶（精仪系博士生毕业生）为该论文的共同通讯作者。精仪系博士毕业生韩勇、赵精晶为该文的共同第一作者。

    流式细胞仪和显微镜是检测细胞的两个基本工具。流式技术具有通量高和分子检测信息丰富的优势，但不能呈现细胞形态信息；相反，荧光显微镜可以提供细胞影像信息，但检测通量低，难以获取足够的样本数据进行统计分析。自流式细胞仪问世以来，其发展趋势一直是保持高检测通量的同时增加更多信息，例如空间形态信息或光谱信息，以实现更准确地细胞分析或分选。成像流式技术兼具流式细胞仪高检测通量和荧光显微镜空间分辨能力的优势，但成像条件苛刻。当细胞以数米每秒的速度运动时，成像系统需要在微秒级别的时间内捕捉到细胞的显微图像。由于存在成像通量、分辨率和检测灵敏度之间的基本矛盾，现有的成像流式技术通常采用复杂的光路系统和图像重构算法，且成像可扩展性也很有限。这使得成像流式细胞仪难以达到传统流式细胞仪那样的高检测通道数，且高昂的技术成本限制了其应用。

    为解决上述问题，清华大学精密仪器系尤政教授课题组提出了一种基于点阵激光激发的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。该方法的核心思想是使用点阵结构光斑替代传统流式细胞仪中的椭圆或条状光斑，从而赋予流式细胞仪成像能力。该方法实现简单，可兼容传统流式细胞仪的光路结构，且有极佳的可扩展性，可使用多个激光激发，同时进行无标记成像与多色荧光成像。该方法可在5m/s的细胞流动速度条件下，实现5000细胞每秒的成像通量和1.3μm的分辨率，同时进行明场成像、多色激光激发与多通道荧光成像。该方法首次实现了全光谱成像流式细胞仪。

    LASE成像技术仅通过改造激发光斑即可给流式细胞仪装上“眼睛”，是目前唯一能用传统流式细胞仪成本实现高通量流式成像的方法，有望使成像流式技术走向大规模科研和临床应用；另一方面LASE极佳的可扩展性也将成像流式细胞仪的多参数检测能力提升至与传统流式乃至光谱流式仪器相当的水平，将为单细胞分析提供更为丰富的信息量。

    该研究得到了国家自然科学基金、生物医学检测技术及仪器北京实验室的资助。

    一列光斑解决流式成像难题

    LASE成像方法本质上是一种单像素成像方法（single pixel imaging），即通过特定的方式将细胞的图像编码到时域信号中，使用单点光电探测器进行探测（如光电倍增管PMT或雪崩光电光APD等），然后从检测到的时域信号中重构出细胞的图像。图1展示了该成像方法的工作原理。在检测区域中，激发光斑呈一串等间隔的点阵光斑，由衍射光学器件生成，光斑间隔大于细胞大小，并且其排列直线与细胞运动直线呈一定的小角度。当细胞依次通过照明光斑时，将产生一串荧光和散射光信号。在图像重构阶段，只需通过信号的分割和重组即可重建细胞图像。从单像素成像的原理上讲，LASE提供了一种近乎极简的图像编码和解码方法：即借助光斑的排列和细胞自身的运动完成对细胞图像的编码，而解码过程也只需对探测器采集的信号进行拆分充足即可解码出细胞的图像。该方法具有实现简单、实时重建的优势，并且与现有流式细胞仪光路结构兼容，因此具有良好的可扩展性，能够在高检测通量的基础上，同时实现多激光、多荧光通道以及无标记成像。

    图1. 点阵激光激发成像原理示意图。

    实现同时多激光激发、无标记、多荧光通道成像

    本研究利用基于LASE成像方法构建了一个成像系统，具备2色激光（488nm/638nm）和5个成像通道（明场、FITC、PE、PI、APC），如图2A所示。该系统经验证在30×30μm的成像视场下，具有1.3μm的空间分辨率。当细胞样本以5m/s的流速经过探测区域后，系统能够进行无标记的明场成像和荧光成像，且不会出现运动模糊，成像通量最高可达每秒5000个细胞每秒。该系统不仅能够对细胞中的细胞器结构进行成像（见图3A），而且可以在多个荧光波段下，实现对不同细胞结构的同时成像（见图3B）。在生物学应用中，图像被广泛视为金标准，因为它能够为细胞分析提供更为丰富和准确的信息，从而更细致准确地进行细胞分型。举例来说，通过图像，可以在传统流式基础上更进一步区分细胞周期M期的细胞核形态，如图3C所示。

图2. 双激光五通道成像流式系统。

图3. 细胞器进行成像与细胞周期研究。

    全光谱成像流式系统

    得益于LASE成像方法的高度可扩展性，该论文将成像荧光信号引入一个基于棱镜色散的32通道光谱仪中，初步验证了全光谱成像流式细胞仪的可行性。该系统在保持每秒5000个细胞的检测速度通量的同时，能够同时在32个光谱通道上对细胞进行成像。借助光谱分解算法，可以有效解决多染料检测实验中染料光谱混叠效应的问题，将成像流式细胞仪的理论可检测染料数扩展至30以上的量级。这将大大提高成像流式细胞仪给单细胞分析带来的信息量。

图4. 32通道全光谱成像流式验证。

    成果优势

    该研究提出的点阵激光激发的成像方法，具有以下优势：

    1.系统简单：采用衍射器件在传统流式细胞仪基础上进行光斑整形，即可实现高通量成像功能，相较于已有成像流式技术，具备显著的成本优势。

    2.图像重建复杂度低：可实现实时重建，进一步可用于基于图像的实时细胞分选。

    3.可扩展性强：该技术可搭配多个激光和更多的检测通道，也可结合光谱检测实现全光谱成像，使成像流式细胞仪达到与传统流式细胞仪和光谱流式细胞仪相当的可检测标记数量。

    该技术提供的高通量和信息量将有效为细胞病理学、多组学、药物筛选、液体活检、单细胞测序等研究领域提供高质量的数据。

相关论文信息

论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Device上

    ▌论文标题：

    Imaging flow cytometry using linear array spot excitation

    ▌论文网址：

    https://www.cell.com/device/fulltext/S2666-9986(23)00183-7

    ▌DOI：

    https://doi.org/10.1016/j.device.2023.100124