曹雪涛院士研究团队在Cancer Communications上发表了题为“MFSD2A potentiates gastric cancer response to anti-PD-1 immunotherapy by reprogramming the tumor microenvironment to activate T cell response”的论文。该研究发现MFSD2A可能作为晚期胃癌（AGC）患者抗PD-1免疫治疗反应的预测标志物，其可能是一个潜在的治疗靶点，MFSD2A通过重编程TME来促进T细胞激活，从而增强抗PD-1免疫疗效。中国医学科学院苏州系统医学研究所张滨博士为本文第一作者，曹雪涛院士为本文通讯作者。迈维代谢为本研究提供了氧化脂质靶向检测和分析服务。
研究背景
胃癌是全球第五大常见癌症。尽管在这一领域最近取得了进展，但晚期胃癌的治疗选择仍然有限。抗PD-1免疫疗法已经用于治疗AGC患者，然而，大多数AGC患者对单药PD-1抗体的反应较差。
抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)免疫疗法在包括胃癌在内的各种癌症中的疗效不佳，需要通过更有效的靶向治疗来增强疗效，或通过识别准确的生物标志物来预测临床反应。本研究主要为确定在晚期胃癌(AGC)中预测或促进抗PD-1治疗反应的分子。
实验思路
在这项研究中，研究者筛选了预测抗PD-1免疫疗法对AGC患者疗效的潜在生物标志物。然后，探索了候选生物标志物在抗PD-1免疫治疗中如何发挥作用，为确定抗PD-1治疗效果提供了有前景的预测生物标志物，并对TME癌细胞代谢重编程如何逆转免疫抑制以增强抗PD-1在AGC中的治疗效果提供了见解。
实验结果
1. 胃癌中较高的MFSD2A表达与对抗PD-1免疫疗法较好的临床反应相关
临床队列包括27名患者，根据患者对托里帕利单抗的最佳总体反应(进展性疾病[PD]、稳定期疾病[SD]或部分反应[PR])分为3组。7名(25.9%)患者对抗PD-1免疫疗法评估为PR，而9名(33.3%)患者评估为PD。因此，比较PR和PD肿瘤的转录谱以确定GC中与抗PD-1免疫治疗敏感性相关的潜在分子机制是非常有意义的。
通过对PR组和PD组之间不同基因的KEGG途径分析，接受托里帕利单抗前患者AGC组织中的潜在上调基因在某些代谢途径中显著富集，意味着代谢分子参与调节抗PD- 1免疫疗法的疗效。与PD组相比，MFSD2A的表达在PR组的AGC患者中增加最显著，表明MFSD2A可能是抗PD-1免疫治疗反应的潜在预测标志物。
为了阐明在没有抗PD-1免疫治疗的情况下，MFSD2A表达是否与胃癌进展相关，对149例胃癌和邻近正常组织样本中MFSD2A表达进行IHC检测。结果显示，胃癌组织中MFSD2A的表达水平明显低于癌旁正常组织。此外，研究人员发现MFSD2A表达与胃癌分期呈负相关。这些结果表明胃癌组织中MFSD2A的低表达可能与TME中的免疫抑制状态有关。
2. MFSD2A增强GC荷瘤小鼠的抗PD-1疗效
使用同源小鼠GC模型来评估MFSD2A对抗PD-1免疫疗法的效果。MFSD2A过表达和对照组荷瘤小鼠分别用抗PD-1抗体或对照IgG处理。IHC证实了MFSD2A的过表达(图1A)。抗PD-1免疫疗法没有显著抑制对照肿瘤的生长。MFSD2A过表达显著抑制肿瘤生长，并显著增强了抗PD-1免疫疗法的疗效(图1B-C).此外，与接种对照GC细胞并用对照IgG治疗的小鼠相比，单独抗PD-1免疫疗法、单独MFSD2A过表达以及MFSD2A过表达联合抗PD-1免疫疗法显著延长了小鼠的生存期(图1D).总之，这些发现表明MFSD2A可以增强抗PD-1免疫疗效。
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图1 MFSD2A增强了抗PD-1免疫疗法在GC荷瘤小鼠中的功效
3. 在GC细胞中过表达MFSD2A使TME具有免疫原性
为了了解MFSD2A如何增强抗PD-1免疫疗法的疗效，使用CyTOF分析肿瘤TME的肿瘤浸润性免疫细胞群，在髓系和淋巴系中使用了针对免疫细胞的各种谱系和功能标记的抗体。使用R软件对来自肿瘤的CD45+免疫细胞进行无监督聚类分析，使用髓系组确定了25个主要免疫细胞群或簇(图2A)。根据不同标志物的表达确定了TME中细胞亚群的数量(图2B)，包括T细胞(CD3+细胞)、B细胞(CD19+和B220+细胞)、自然杀伤细胞(NK；NKp46+细胞)、树突状细胞(DC；CD11c+和MHCII+细胞)、巨噬细胞(CD11b+和F4/80+细胞)、MDSC (CD11b+和Ly6C+细胞)、嗜神经细胞(CD11b+和Ly6G+细胞)和其他(CD44+和CD103+细胞)。评估了MFSD2A水平和肿瘤浸润性免疫细胞群百分比之间的相关性。结果显示，与对照TME相比，在单独的MFSD2A过表达或与抗PD-1免疫治疗TME组合中，T细胞群增加，而TAM细胞群减少。然而，其他细胞群没有受到MFSD2A过表达的显著影响(图2C)。进一步根据各种标记的表达对免疫细胞进行分类(图2B)。T细胞(亚群22：CD3+、CD8+、Ly6C+和CD86+细胞)显著富集，而T细胞(亚群1：CD3+、CD8+和Ly6C-细胞)、M2样巨噬细胞(亚群17：CD11b+、F4/80+、CD206+和CD163+细胞)以及CD11b+、F4/80+和PD- L1+巨噬细胞(亚群4)在MFSD2A过表达或联合抗PD-1治疗的肿瘤样品中显著减少(图2D)。为了进一步阐明MFSD2A表达对T细胞的重编程，鉴定和提取了淋巴细胞(T细胞、NK细胞和B细胞)用于进一步聚类分析(图2E)。使用特定的标记对聚类进行注释(图2F)。无论有无抗PD-1免疫治疗肿瘤，耗竭CD8+ T细胞，包括亚群1 (CD3+、CD8+、PD-1+、TIM3+和GZMBlo细胞)和亚群7 (CD3+、CD8+、PD-1+和TIM3+细胞)，在MFSD2A过表达的样品中显著减少(图2G)。具有高表达穿孔素和颗粒酶B以及相对低表达PD-1和TIM3的效应CD8+ T细胞(亚群9)在MFSD2A过表达后增加(图2G)。多色FACS和IHC分析也证实了MFSD2A过表达肿瘤样品中CD8+ T细胞群的增加。
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图2 MFSD2A对GC荷瘤小鼠的TME进行重编程
作为抗肿瘤免疫的主要群体，TME中的T细胞在宿主对抗PD-1免疫疗法的反应中起着至关重要的作用。为了进一步阐明T细胞是否参与MFSD2A介导的抗肿瘤免疫，研究人员用CD8α抗体治疗MFSD2A过表达的荷瘤小鼠，发现CD8+ T细胞的剔除几乎消除了MFSD2A介导的抗肿瘤作用(图3A-B)，表明MFSD2A的抗肿瘤作用依赖于CD8+ T细胞。为了进一步探究MFSD2A在T细胞活化中的功能，将MFC细胞与来自MFSD2A过表达或对照MFC肿瘤样品的CD8+ T细胞共培养。结果显示，当MFSD2A过表达时，CD8+ T细胞中颗粒酶B和IFNγ的水平增加(图3C-D)。当来自人PBMCs的CD8+ T细胞与MFSD2A过表达的MGC803细胞一起孵育时，也观察到类似的结果。(图3E-F)。相比之下，当与MFSD2A沉默的MGC803细胞孵育时，来自人PBMCs的CD8+ T细胞的颗粒酶B和IFNγ水平降低(图3G-H)。此外，当与MFSD2A过表达的GC细胞一起孵育时，来自MFSD2A过表达的肿瘤或人PBMCs的CD8+ T细胞的细胞毒性增强(图3I-J)，而当与MFSD2A沉默的MGC803细胞一起孵育时，T细胞毒性降低(图3K)。这些结果表明，MFSD2A可重编程TME，促进T细胞活化，从而增强抗PD-1免疫治疗的疗效。
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图2 GC细胞中MFSD2A的表达增强了CD8+ T细胞的活化
4. MFSD2A抑制GC细胞产生TGFβ1，增强CD8+ T细胞的活化
转录组分析显示，在MFSD2A沉默的MGC803细胞中，TGFβ1的表达显著增加，而其他免疫抑制因子，如PD-L1、PVR细胞粘附分子(PVR)和IL10的表达没有显著变化(图4A)。这些结果在MFSD2A沉默的MGC803细胞中通过qRT-PCR得到证实(图4B)。在MFSD2A沉默的MGC803细胞(图4C)中，TGFβ1的分泌增加，但是在MFSD2A过表达的MGC803细胞(图4D)和MFC细胞(图4E)以及来自MFSD2A过表达荷瘤小鼠的肿瘤组织中，TGFβ1的分泌减少(图4F-G)。
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图4 MFSD2A抑制GC细胞释放TGFβ1
进一步的实验表明，用TGFβ1特异性阻断剂阻断TGFβ1信号传导，有效地消除了MFSD2A缺陷诱导的对CD8+ T细胞的抑制作用(图5A-B)。此外，IHC分析显示，TGFβ1表达与胃癌组织中MFSD2A表达和CD8+ T细胞浸润呈负相关(图5C-D)。表明GC细胞中的MFSD2A通过抑制TGFβ1的产生而增强CD8+ T细胞的活化。
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图5 MFSD2A通过抑制GC细胞TGFβ1表达促进CD8+ T细胞活化
5. MFSD2A通过限制Cox2-前列腺素抑制胃癌细胞TGFβ1释放
MFSD2A作为运输长链脂肪酸的膜蛋白在细胞内脂质代谢中发挥重要作用，研究人员分析了MFSD2A过表达和MFSD2A沉默的MGC803细胞中脂质代谢物的变化。结果显示MGC803细胞中前列腺素的合成，包括前列腺素E2 (PGE2)、前列腺素B2 (PGB2)和前列腺素J2 (PGJ2)在MFSD2A过表达时被显著抑制(图6A-B)，而在MFSD2A沉默时这些前列腺素合成增加(图6C-D)。类似地，在MFSD2A过表达的肿瘤组织中，前列腺素水平显著降低(图6E-F)，表明MFSD2A抑制前列腺素的合成。通过分析转录数据，进一步发现COX2(一种前列腺素合成限速酶)在MFSD2A沉默的MGC803细胞中增加。MFSD2A沉默上调MGC803细胞中COX2的表达，而MFSD2A过表达下调MGC803细胞中COX2的表达(图6G-H)，表明MFSD2A可能作为Cox2-前列腺素表达的抑制因子。当与MFSD2A沉默的MGC803细胞共培养时，对CD8+ T细胞活化的抑制作用可通过COX2抑制剂塞来昔布预处理得到很大程度的恢复(图6I-J)。用另一种COX2抑制剂布洛芬抑制COX2，大大消除了MFSD2A沉默诱导的TGFβ1产生。当用Darapladib(一种Lp-PLA2的抑制剂，其可以抑制ARA及其代谢物前列腺素的合成)处理MFSD2A沉默的MGC803细胞时，也观察到类似的结果(图6K)。此外，当MFSD2A过表达的MGC803细胞用PGE2或其上游代谢物ARA预处理时，MFSD2A过表达导致的TGFβ1释放的减少在很大程度上被消除(图6L)。因此，这些发现表明MFSD2A限制COX2-前列腺素介导的TGFβ1产生并促进T细胞活化。
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图6 MFSD2A通过限制Cox 2-前列腺素-TGFβ1轴促进T细胞活化
迈维小结
该研究报道MFSD2A通过抑制Cox2-前列腺素的合成来抑制GC细胞中TGFβ1的产生，促进TME中CD8+ T细胞的活化，并增强GC患者中抗PD-1免疫疗法的疗效。本实验数据揭示了一种新的抗PD-1免疫疗法的预测标志物，并描述了一种新的抗PD-1免疫疗法的增敏机制。
科研延伸
氧化脂质：是指多不饱和脂肪酸（PUFAs）发生自动氧化或者是在特定酶的作用下生成的一系列氧化代谢产物。迈维代谢通过自建数据库，一次性对141种氧化脂质进行绝对定量检测。使用内标+外标双重验证的绝对定量方法，覆盖广、定量准，适合各类炎症或免疫相关疾病以及肠道微生物与宿主互作研究。
