编辑丨王多鱼

    排版丨水成文

    基因编辑技术在生物学研究和临床基因治疗中扮演着核心角色。这一技术利用可编程的内切酶，例如Cas9和Cas12a，诱导内源性DNA修复途径，特别是双链损伤断裂（double-strand break，DSB）修复，修复过程包括易出错的非同源末端连接（NHEJ）和精确的同源定向修复（HDR）两种主要途径。

    然而，HDR的效率相对较低，成为实现精确基因编辑的主要障碍。通过抑制NHEJ修复途径，例如使用小分子M3814等策略，HDR效率有所提高。尽管如此，外源DNA供体的参与仍然是HDR效率的限制因素。

    单链DNA供体在HDR效率和细胞毒性方面通常优于双链DNA供体。因此，提高单链DNA供体介导的HDR效率成为多数研究的重点。其中，最有效的方法是将其与Cas9 RNP复合物结合。这些策略表明，单链DNA供体与目标位点的距离是决定HDR效率的关键。然而，这些方法需要对Cas9蛋白和/或ssDNA供体进行化学修饰，存在诸多不足，如不适用于mRNA脂质纳米颗粒和病毒递送系统、与其他可编程核酸酶不兼容、可能降低Cas9活性以及增加生产成本等。因此，开发无需化学修饰的方法来提高单链DNA供体的HDR效率具有重要意义。

    2024年8月10日，中国医学科学院基础医学研究所刘德培院士团队在 Nature Communications 期刊发表了题为：Enhancing homology-directed repair efficiency with HDR-boosting modular ssDNA donor（模块化单链DNA供体提高同源定向修复效率）的研究论文。

    该研究报道了在传统单链DNA供体（ssDNA donor）的5'端连接同源定向修复（homology-directed repair，HDR）增强模块，可实现对内源基因位点高效的精确编辑。

    单链DNA不仅承担着传递遗传信息的基本功能，还具备多种生物活性，例如作为病原体相关分子模式激活先天免疫反应，作为反义寡核苷酸调控基因表达，以及作为适配体调节蛋白质功能等。这些功能依赖于单链DNA与细胞内蛋白质之间的特定相互作用。

    基于这一原理，研究团队提出了一项创新策略，即利用单链DNA的特异序列，将其与DSB修复相关的内源蛋白相结合，从而促进单链DNA供体在DSB位点的高效聚集和应用（见图1）。

图1. 功能序列模块增强单链DNA供体的效力

    研究团队通过寡聚脱氧核苷酸免疫共沉淀（ODN immunoprecipitation，ODIP）-Seq实验，揭示了内源DSB修复相关蛋白（例如RAD51）具有序列偏好的ODN结合活性。在单链DNA供体的5'端连接RAD51高亲和力序列（即HDR增强模块）后，能够显著提升其与RAD51蛋白的结合能力，从而有效提高单链DNA供体在Cas9、nCas9、Cas12a等系统以及多种细胞的不同基因位点中的HDR效率。通过联合使用DNA-PKcs抑制剂M3814或HDRobust策略，这种模块化的单链DNA供体实现了高达90.03%的HDR效率（见图2）。

图2. HDRobust或M3814提高模块化单链DNA供体的效率

    该设计通过在单链DNA供体的5'端接入特定的天然DNA序列，促进了与细胞内源性蛋白的相互作用，从而免除了对化学修饰的依赖。这一策略不仅提升了操作的便捷性和安全性，而且在基因编辑的精确性和效率上实现了显著进步。

    模块化的设计理念为单链DNA供体的多功能化提供了可能，为基因编辑技术的临床应用和基础研究开辟了新的路径。这一技术的创新和应用，为解析基因功能、治疗遗传疾病以及推动生物工程领域的进展提供了强有力的工具。

    该研究工作得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2021-I2M-1-016、2022-I2M-2-001和2023-I2M-2-005）等项目的资助。中国医学科学院基础医学研究所刘德培院士和陈厚早教授为论文共同通讯作者，博士生金莹莹和助理研究员张鹏为论文的共同第一作者。

    论文链接：

    https://www.nature.com/articles/s41467-024-50788-x