撰文：Candy

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    亮点：

    该研究开发了一种不易诱导病毒中和抗体的溶瘤病毒——rVSV-LCMVG，并进一步证实了该溶瘤病毒与过继转移T细胞或mRNA癌症疫苗联合使用，可增强抗肿瘤效果。

        近日，厦门大学夏宁邵院士团队在国际知名期刊Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了最新的研究工作“Combination therapy with oncolytic virus and T cells or mRNA vaccine amplifies antitumor effects”。肿瘤免疫治疗的首要目标是激发宿主的抗肿瘤免疫力，建立免疫敏感的微环境，最终实现肿瘤缩小。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗的实施过继转移 T 细胞疗法的一种形式，在 B 细胞恶性肿瘤的治疗中已经超出了预期。一旦到达肿瘤微环境 (TME)，大多数 T 细胞就会遇到障碍和免疫抑制因素，阻碍其扩张、浸润和诱导肿瘤特异性细胞毒性的能力。溶瘤病毒 (OV) 的抗癌作用主要通过直接裂解肿瘤来实现细胞并对抗肿瘤内的免疫抑制微环境。本研究提出了OVS与过继T细胞转移或编码肿瘤相关抗原的mRNA疫苗的合理联合治疗，并从协同效应和机制方面进行了研究。

    1、OV 将 GP33 递送至实体瘤细胞可在体外改变 P14 T 细胞的活性和细胞毒性

    泡性口炎病毒（VSV）是一种潜在的溶瘤病毒载体，将VSV的G蛋白替换为淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的G蛋白，将改造后的重组病毒命名为rVSV-LCMVG（图1a）。电镜观察显示，rVSV-LCMVG保持了原来的子弹形颗粒，在抗VSV-Rat血清中可检测到病毒蛋白VSV-N、VSV-P和VSV-M的表达，用抗LCMVG单克隆抗体（mAb）可检测到LCMVG蛋白的存在（图1b）。rVSV-LCMVG对多种肿瘤细胞系均表现出显著的细胞毒作用，即使在感染复数（MOI）低于0.01的水平下也是如此。值得注意的是，它对肝癌细胞和肺癌细胞系表现出特别强的杀伤作用，凸显了其作为溶瘤病毒的潜力（图1c）。

    与野生型VSV相比，rVSV-LCMVG还表现出显着增强的安全性。颅内注射 1 × 102野生型VSV的斑块形成单位（PFU）导致所有小鼠死亡，而所有接受1×106的小鼠rVSV-LCMVG的PFU存活（图1d）。与野生型 VSV 相比，改良的 rVSV-LCMVG 在多次静脉注射后诱导产生中和抗体的倾向较低 (图 1e)。与单独感染rVSV-LCMVG或单独与P14细胞共培养的B16-OVA细胞相比，接受rVSV-LCMVG联合感染和P14细胞共培养的组在每个时间点表现出显着更高的杀伤水平（图1f）。

    CD69和ICOS用作T细胞活化表面标记，而细胞表面的CD107a水平和上清液中干扰素-γ(IFN-γ)的浓度用于评估P14细胞功能。 P14 T 细胞与rVSV-LCMVG 感染的 B16-OVA细胞共培养 16 小时，其活性表现出依赖于 rVSV-LCMVG MOI 的稳健性（图 1g，h）。这些发现表明 OV 具有向肿瘤递送抗原（在本例中为 LCMVG）的能力，并增强抗原特异性 T 细胞介导的抗肿瘤反应。

    图1. rVSV-LCMVG的表征，可有效地将 GP33 递送至肿瘤细胞，以指导体外 P14TCR-T 细胞的激活和细胞毒性。

    2、肿瘤反应性和OV反应性P14 T细胞赋予更强的抗肿瘤免疫力

    利用表达外源抗原 GP33 的 B16-GP33 黑色素瘤模型来评估rVSV-LCMVG 和 P14 细胞联合疗法的有效性。在皮下注射 B16-GP33 细胞后，一旦肿瘤大小达到约 100 mm3，便在第 0 天转移 P14 细胞，相对于治疗。第二天，即第 1 天，每 3 天向肿瘤内 (i.t.) 注射 rVSV-LCMVG 1 × 107 PFU，连续 12 天（图 2a）。注射rVSV-LCMVG后10天，用P14 T细胞或单独使用rVSV-LCMVG治疗的小鼠显示肿瘤体积适度减少，而P14联合rVSV-LCMVG组在19天后完全消除肿瘤。此外，接受双重治疗的患者存活超过 35 天，直到实验结束（图 2b）。因此，为了解决全身注射 OV 的有限治疗效果，通过静脉注射与先前瘤内注射相同的剂量将rVSV-LCMVG 与 P14 组合来提高治疗效果。在给予rVSV-LCMVG前一天，将P14转移到携带B16-GP33的小鼠中（图2c）。

    与接受PBS治疗的组相比，接受静脉内施用rVSV-LCMVG的组中进展的肿瘤保持相似的水平。然而，当P14联合静脉注射rVSVLCMVG时，肿瘤治疗效果和生存率显着提高（图2d）。使用流式细胞术检查了肿瘤和周围区域中 P14 细胞的数量、表型和功能，观察到P14移植组中P14细胞功能的变化。P14联合rVSV-LCMVG组中的P14细胞显示LAG3和PD-1的表达水平降低，以及ICOS的表达水平升高（图2e，f）。此外，与单独用 P14 细胞治疗的组相比，从肿瘤（获得的 P14 细胞在用 P14 细胞和 rVSV-LCMVG组合治疗的组中显示出更高的丰度（图2g、h）。 P14 转移组中的 P14 细胞在离体再刺激时也表现出较低水平的IFN-γ 和 GZMB。与P14转移组相比，P14联合rVSV-LCMVG组中的P14细胞在离体再刺激时产生更多的IFN-γ和GZMB（图2i，j），表明P14细胞在TME中的功能得到改善。

图2. rVSV-LCMVG联合P14细胞在B16-GP33肿瘤模型中的抗肿瘤效果。

    3、OVs增强肿瘤特异性T细胞和OV特异性T细胞的抗肿瘤功能

    首先皮下注射黑色素瘤细胞系B16-OVA，当肿瘤大小达到约100mm3时，在第0天（相对于治疗）转移适量的P14和OT-I（每只小鼠2×106个细胞）。第二天，接着进行四剂溶瘤病毒治疗，每三天一剂，rVSV-LCMVG 1 × 107 PFU/剂（图3a）。在瘤内注射四剂 1 × 107 PFU rVSV-LCMVG 的小鼠中，观察到肿瘤负荷适度下降，总体生存率提高。此外，在接受联合治疗的组中观察到显着的肿瘤抑制，从而更有效地延长了小鼠的存活率。（图3b）。除了瘤内给药外，还评估了B16-OVA肿瘤模型中静脉注射溶瘤病毒与T细胞联合的治疗效果（图3c）。

    与单一治疗组相比，T细胞联合静脉注射溶瘤病毒在抑制肿瘤生长和延长小鼠寿命方面表现出显着的治疗效果（图3d）。从肿瘤中分离的肿瘤特异性 OT-I T 细胞表现出高水平的 PD-1和 LAG3，而从相同肿瘤中分离的旁观者 P14 细胞显示出这些标记物水平低得多。此外，当与rVSV-LCMVG联合治疗时，OT-I细胞中PD-1和LAG3的表达减少，而ICOS的表达增加（图3e，f）。此外，转移后5天，OT-I&P14治疗组中OT-I和P14细胞均浸润肿瘤，与B16-OVA肿瘤中的非特异性P14细胞相比，OT-I细胞表现出更高水平的浸润，同时增强在存在rVSV-LCMVG 的情况下观察到病毒特异性 P14 T 细胞的募集。此外，肿瘤、引流淋巴结和脾脏也表现出类似的趋势（图3g、h）。

图3. rVSV-LCMVG与 P14、OT-I 细胞联合治疗在 B16-OVA肿瘤模型中的抗肿瘤功效。

    4、OT-I 和 P14 TIL 的转录特征

    对从患有 B16-OVA肿瘤的两个治疗组的小鼠中获得的分选的肿瘤特异性和病毒特异性 T 细胞进行了 RNA 测序(RNA-seq) 分析。 RNA-seq结果表明，与单一疗法治疗的小鼠相比，联合疗法治疗的小鼠肿瘤特异性和病毒特异性T细胞的基因表达谱发生了显着变化（图4a、b）。过继转移后第 5 天，与先前的流分析同时进行基因组变异分析的通路富集。在溶瘤病毒联合过继性T细胞治疗组中，OT-I和P14细胞均表现出细胞因子活性、颗粒酶介导的细胞死亡途径和T细胞增殖的正向调节的富集。值得注意的是，联合治疗导致 P14 CD8+ T 细胞中颗粒酶介导的细胞死亡途径富集（图4c、d）。

    已知与 T 细胞耗竭相关的各种抑制性受体和转录因子（如 Tox、Slamf6、Egr2 和 Eomes）的表达在接受rVSVLCMVG 和rVSVLCMVG 联合治疗的小鼠的 OT-I 细胞中表达下调。 T 细胞，与从单一疗法组分离的细胞相比。相反，在接受联合治疗的小鼠中，编码效应分子和炎症细胞因子受体的基因表达上调，包括 Gzmb、Gzmk、Gzma、Ccr5、Ifng 和 Stat1。 （图4e、f）。此外，联合疗法不仅逆转了肿瘤抗原特异性T细胞OT-I的耗尽表型，而且还通过增强病毒特异性T细胞产生细胞因子来放大抗肿瘤作用（图4g，h）。研究结果表明，联合疗法治疗的 OT-I 和 P14 T 细胞均表现出疲劳特征的减少，同时效应特征的增加。

图4. OT-I 和 P14 T 细胞与B16-OVA 中的rVSV-LCMVG 组合时具有不同的转录谱。

    5、通过 scRNA-seq 对 TME 中的抗肿瘤 T 细胞进行转录谱分析

    对经过各种体内治疗的这些 T 细胞进行了单细胞 RNA 测序(scRNA-seq) 分析。根据其特征将这些 T 细胞分为十个主要簇（图5a）。未经rVSV-LCMVG 刺激的 OT-I T 细胞主要存在于耗尽的 T 细胞簇（G2m 期 Tex、S 期 Tex 和 Tcf7+ Tex）中。然而，当TME被rVSV-LCMVG重塑时，OT-I T细胞主要属于效应T细胞簇，包括早期激活的T细胞、ISG+ Teff细胞、Temra细胞和Il7r+ Tem细胞（图5b）。此外，OT-I细胞在用组合OV处理后表现出Runx3表达升高。这表明这些OT-I细胞可能在肿瘤组织中持续存在较长时间，从而发挥抗肿瘤作用（图5c）。与之前的发现一致，rVSV-LCMVG 的施用通过促进 Tex 分化为效应 T 细胞来改善肿瘤特异性 T 细胞的耗竭表型。rVSV-LCMVG 给药促进肿瘤特异性耗尽（Tex）分化为效应（Teff）和记忆（Tmem）细胞，且 Tex 比例显着下降（图 5d，e）。

图5. 使用scRNA-seq 对 OT-I 肿瘤特异性 CD8+ T 细胞进行转录分析。

    6、mRNA肿瘤疫苗联合溶瘤病毒提高B16肿瘤治疗效果

    接下来，制备了可以表达gp33表位的mRNA肿瘤疫苗，并使用特异性识别gp33表位的早期G2B1抗体通过免疫荧光验证了gp33在细胞水平的表达。首次接种后间隔14天，再接种相同剂量的疫苗以增强免疫反应。随后，五天后，观察到脾脏中特异性 T 细胞数量增加（图 6a、b）。 IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）测试结果显示，当用gp33-41抗原肽离体刺激时，来自免疫小鼠脾脏的T细胞有强烈的反应（图6c，d）。为了确定 mRNA 疫苗与 OV 联合消除体内已形成肿瘤的功效，对每只小鼠皮下注射 2 × 106个B16-GP33 细胞。一旦注射部位明显形成肿瘤，就进行肌肉免疫，每只小鼠接受 10 μg mRNA 剂量。间隔 7 天后，进行溶瘤病毒治疗（图 6e）。

    与 PBS 组相比，瘤内注射 rVSVLCMVG 或 mRNA疫苗单一疗法可适度抑制肿瘤生长。瘤内或静脉注射rVSV-LCMVG 与 mRNA 疫苗的联合治疗很大程度上改善了 B16-GP33 肿瘤的反应性并延长了这些小鼠的生存期（图 6f、g）。在mRNA疫苗联合治疗中，rVSV-LCMVG溶瘤病毒静脉注射组的治疗效果优于瘤内注射组。这可能归因于在用mRNA疫苗免疫后，静脉注射OVs比瘤内注射刺激了更强烈的全身免疫反应。结果，特异性T细胞的产生增加，治疗效果得到改善。即使在B16-OVA模型中，mRNA也只能诱导病毒特异性T细胞的产生，这也强调了联合治疗方法产生了更好的治疗效果（图6h、i）。

    研究结果强调，在使用mRNA诱导溶瘤病毒特异性T细胞或肿瘤特异性T细胞时，与溶瘤病毒联合治疗将产生更好的治疗效果，尤其是当mRNA诱导的特异性T细胞能够同时识别肿瘤和OV时，即使静脉注射溶瘤病毒，小鼠也会获得比单一疗法更好的治疗效果。

图6. mRNA肿瘤疫苗联合溶瘤病毒提高治疗效果。

    综上所述，研究表明，OV 能够增强肿瘤 mRNA 疫苗的抗肿瘤效果。流式细胞术和单细胞 RNA 测序分析提供了令人信服的证据，表明 OV 可以改变免疫抑制性 TME。这种调节导致肿瘤特异性 T 细胞分化为有效的效应细胞，而不是耗尽的细胞。这些发现揭示了 OV 增强 T 细胞治疗功效的潜在机制。

    教授介绍

    夏宁邵，中国工程院院士，厦门大学生命科学学院/公共卫生学院教授、国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心主任、传染病疫苗研发全国重点实验室主任、翔安创新实验室主任，曾任厦门大学公共卫生学院院长。长期从事传染病疫苗和诊断试剂创新与转化应用研究，开创了原核表达类病毒颗粒人用疫苗工程技术体系，完成一系列传染病疫苗和诊断试剂的转化应用。

    参考文献

    Fu R, Qi R, Xiong H, et al. Combination therapy with oncolytic virus and T cells or mRNA vaccine amplifies antitumor effects. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):118. Published 2024 May 3. doi:10.1038/s41392-024-01824-1