通过设置荧光探针或结合物理的受激辐射现象，超分辨（Super-resolution, SR）荧光显微镜已经突破分辨率的衍射极限（200nm～300nm）。然而，其对超分辨信息的提取能力往往严重依赖于数据的计算与处理过程。样本化学环境、光学设置条件等因素会在重构中对图像产生影响，造成噪声与失真，降低超分辨图像质量。因此，对超分辨图像进行可靠且无参考的质量评估，对于有效量化误差从而进行进一步分析具有重大意义。尽管目前已有几种方法可对超分辨图像质量进行评估，但仍过于粗糙，无法有效关联成像内容。超分辨技术所带来的分辨率提升需要领域开发更精细的无参考成像质量评估手段。因此，迫切需要一种通用稳定无参考的超分辨图像质量评价工具，来精密、准确地量化超分辨显微技术的重建误差。

    近日，哈尔滨工业大学赵唯淞/李浩宇团队，北京大学陈良怡团队及南开大学潘雷霆团队联合在Light: Science & Applications上发表论文Quantitatively mapping local quality of super-resolution microscopy by rolling Fourier ring correlation。哈尔滨工业大学赵唯淞助理教授为论文第一作者，哈尔滨工业大学李浩宇教授和北京大学陈良怡教授为论文的通信作者。其中，论文共同第一作者还包括北京大学黄小帅助理教授和南开大学杨建宇博士后，共同通信作者还有南开大学潘雷霆教授和北京大学赵士群副研究员。哈尔滨工业大学谭久彬院士为论文共同作者。

    他们提出可以利用滚动傅里叶环相关（rolling Fourier ring correlation, rFRC）方法来评估超分辨尺度下的重建不确定度。同时将 rFRC 方法与改进的分辨率比例误差图（Resolution scaled error map, RSM）相结合，提出了一种像素级误差量化方法（Pixel-level analysis of error locations, PANEL），能够通用、无参考地生成超分辨尺度下像素级误差定量图，为生物分析精确定位可靠性较低的区域，判定精度最高可提升10倍。此外，rFRC 可精确比较不同单分子定位显微镜（Single-molecule localization microscopy, SMLM）恢复算法的性能，促进了超分辨尺度下不同重建图像的有效融合，最大限度降低了潜在误差，实现了大视场单分子定位纳米级极限空间分辨成像。团队提供了rFRC完备的MATLAB和Python开源代码，以及开箱即用的Fiji/ImageJ插件，使得其能够与多种模态光学（超分辨）成像技术结合，成为一种易于使用的本地质量评估工具。

    应用举例1：有效评估单分子定位数据的分辨率异质性

    研究者利用单分子定位微管数据集对提出的评估方法进行了验证（如图1）。通过大视场STORM【1】获得的超分辨微管二维图像显示，细丝交叉点和细胞核周区域的分辨率，因射体聚集和失焦效应而明显较低（图1左）。细胞骨架呈现由核周区域至外围区域逐渐稀疏的特点，rFRC 成功绘制出这种特征引起的分辨率异质性（图1右）。

    图1 | rFRC 评估定位显微镜的超分辨率图像。左图：COS-7 细胞中用 Alexa Fluor 647 标记的 α-微管蛋白的 STORM 重建结果及其rFRC 图。右图：STORM 结果（亮绿色）和高斯平均 rFRC 图（shifted jet图）的合并视图，用于突出显示低质量区域。比例尺：5 μm.

    应用举例2：实现单分子定位图像最优融合

    使用 rFRC 图可获得超分辨图像的不确定度分布，在此基础上，研究者比较了不同重建算法的局部性能，根据其针对不同特征区域的重建特性，进行融合重建（图2a）。其利用2D-STORM对固定COS-7细胞中免疫标记的微管蛋白进行成像，并使用多激发体最大似然估计（Multi-emitter MLE，ME-MLE）【2】和单激发体高斯拟合（Single-emitter Gaussian fitting，SE-Gaussian）【1】恢复重建。通过组合两种算法重建之间具有最低局部rFRC值的区域（图2c中的第三列），融合结果表现出更好的视觉质量、最低的总体 rFRC 值（0.96与1.26和4.14，图2b）以及更均匀的空间分辨率分布（图2d、2e）。而与rFRC 图相比，由于RSM方法无法在超分辨尺度上对重建错误进行准确提取，其未能从STORM图像中识别出图中的复杂结构的误差表征（图2f）。

    图 2 | 利用 rFRC 图对 STORM 重建结果融合。(a) STORM 融合示意图。ME：多发射器最大似然估计结果；SE：单发射极高斯拟合结果。(b) 图d中白框部分的放大视图：STORM 结果（COS-7 细胞，用Alexa Fluor 647标记的α-微管蛋白，左）及其rFRC图（右）。从上到下：“ME”结果；“SE”结果；“ME”和“SE”重建的融合结果。相应的 rFRC 值标记在 rFRC 图的左上角。(c) 图b中虚线圆圈的放大视图。从左到右为：ME结果、SE结果、融合权重（ME 结果和 SE 结果的反向 rFRC 映射分别合并为绿色和洋红色通道）以及融合的 STORM 结果。(d) 融合STORM结果的完整视图（COS-7 细胞，用 Alexa Fluor 647 标记的 α-微管蛋白）。(e) 图d的rFRC图。图中显示了与SE（22.0% 区域为 80.55 ± 1.52 nm，中空）和ME（19.2% 区域为 4.28 ± 0.14 nm，白色实心）处理结果相比，融合重建结果的分辨率提高。(f)图d中黄色框包围的放大区域。上到下显示为：rFRC图、融合STORM和RSM的结果。比例尺：(b, c) 500 nm; (d) 5 μm; (f) 1 μm;

    应用举例3：PANEL 可评估多种超分辨显微技术

    除融合重建外，PANEL因其原理通用性可广泛应用于评估其他模态的超分辨技术。研究团队将Hessian 去噪算法【3】应用于Wiener-SIM重建【4】（图3a）以获得Hessian-SIM图像（图3b）。与两张图像相等的RSM值（RSM值：0.27与0.27）相比，rFRC 值准确反映出Wiener-SIM和Hessian-SIM之间在保真度上的细微差异（rFRC 值：1.36与1.24）（图3c）。此外，rFRC 还可用于确定Richardson-Lucy（RL）解卷积算法的迭代次数。研究者应用RL解卷积处理TIRF图像（图3d），并计算每次迭代的相应rFRC值（图3e，3g）。分析rFRC随迭代次数的变化特性，可确定RL解卷积迭代重建次数，获得最佳的重建效果。

    图 3 | rFRC 图辅助和评估了多种光学成像方法。(a) 在 Wiener-SIM（顶部）和 TIRF（底部）成像下用 LifeAct-EGFP 标记的活人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 的代表性图像。(b) Hessian-SIM 结果。(c) Hessian-SIM 的 rFRC 图。Wiener-SIM（洋红色）和 Hessian-SIM（青色）的 rFRC、RSP 和 RSE 值显示在右下角。(d) 在 RL 去卷积（顶部）和 TIRF（底部）成像下用 DiI 标记的固定肝窦内皮细胞 (LSEC) 的代表性结果。(e) RL 反卷积结果的 rFRC 图。(f) (d) 中白框的放大视图。原始 TIRF 图像、80 次和 200 次迭代的 RL 反卷积结果以及 TIRF-SIM 结果分别显示在左上、右上、左下和右下。(g) 迭代过程中的 PSNR（相对于 TIRF-SIM）、RSP（相对于 TIRF）和 rFRC 值的曲线。比例尺：(a) 1 μm; (d) 5 μm; (f) 100 nm;

    总的来说，rFRC与PANEL 技术揭示了图像空间信息的不确定性，不仅为基于超分辨图像的生物分析提供了重要支持，并有可能推动计算显微成像领域的进一步发展。研究者们期望 PANEL 可以广泛用作跨模态工具，成为广泛应用的生物分析方法，为超分辨显微技术的创新提供有力工具，推动计算显微镜领域获得更大的进步。并支持现有的计算超分辨成像技术形成真正的定量化与可复现性（专家点评NBT | 陈良怡/李浩宇合作团队发明计算超分辨图像重建算法，稳定提升荧光显微镜2倍分辨率）（Nat. Photonics|荧光显微的原位超分辨引）。最后，团队已整合出一系列开源资源，包括MATLAB【5】与Python【6】程序包以及ImageJ/FIJI【7】插件，希望广大的超分辨显微镜使用者与开发者能够在日常工作中借用该定量化评价工具的能力，评估、精进每次成像实验的质量。更多背后的故事可以参看“超分辨显微镜的下一块拼图”文章背后的故事博文【8】。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

    相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-023-01321-0

    参考文献

    1. Huang, B. et al. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science, 2008, 319: 810-813.

    2. Ovesny, M. et al. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics, 2014, 30: 2389-2390.

    3. Huang, X. et al. Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nature Biotechnology, 2018, 36: 451-459.

    4. Gustafsson, M. et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal, 2008, 94: 4957-4970.

    5. MATLAB代码：https://github.com/WeisongZhao/PANELm

    6. Python代码：https://github.com/WeisongZhao/PANELpy

    7. ImageJ/FIJI插件：https://github.com/WeisongZhao/PANELJ

    8. Weisong Zhao, A nice piece of the puzzle for super-resolution microscopy. Nature Engineering Community (2023). https://engineeringcommunity.nature.com/posts/a-nice-piece-of-the-puzzle-for-super-resolution-microscopy