交叉学科

Interdisciplinary

    2023年7月31日，云南大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室张亚平院士团队在Cell Press细胞出版社旗下交叉学科期刊iScience上发表了题为“Remote regulation of rs80245547 and rs72673891 mediated by transcription factors C-Jun and CREB1 affect GSTCD expression”的研究论文。作者采用RT-PCR、3C、双荧光报告分析、ChIP、RNAi、基因编辑和EMSA等实验技术对rs10516526和GSTCD基因的相互作用机制进行研究，发现1) GSTCD mRNA的低表达与COPD相关；2) Rs10516526的强连锁位点rs80245547和rs72673891通过远程增强子-启动子相互作用调控GSTCD基因；3) C-Jun和CREB1是rs80245547和rs72673891调控GSTCD基因所必需的；4) Rs80245547T和rs72673891G对C-Jun和CREB1的结合能力较强。这些发现为理解COPD中rs10516526和GSTCD调控机制提供了新的视角。

    相关背景

    慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）是一种以肺功能下降为特征的常见呼吸系统疾病，该病发病率高，死亡人数多，是全球第三大死亡原因。遗传因素可增加COPD发病的危险性。近年来大量COPD全基因组关联研究揭示位于GSTCD（Glutathine S-transferase, C-terminal domain）基因内含子区SNP位点rs10516526（或与之相连锁的SNP位点）与FEV1及COPD密切相关，却未对rs10516526和GSTCD在COPD中的调控机制开展深入研究。

    结果解读

    1）GSTCD mRNA的低表达与COPD相关

    GSTCD是一个与肺功能相关基因，为确定GSTCD基因与COPD的关系，张亚平团队首先对临床诊断为COPD（FEV1 < 80%）的20例疾病组和26例对照组（FEV1 ≥80%）的肺组织样本进行RNA提取，通过RT-PCR比较两个分组中GSTCD的表达量，发现COPD疾病组GSTCD表达量显著低于对照组（图1）。

图1：GSTCD基因在COPD疾病组和对照组的相对表达量。

    2）Rs10516526的强连锁位点rs80245547和rs72673891通过远程增强子-启动子相互作用调控GSTCD基因

    多项GWAS研究结果均指出：在GSCTD基因内含子区的rs10516526，（或与之连锁的 rs11097901、rs11728716）与肺功能指数（FEV1）及COPD显示出强烈的相关性。GWAS筛选出功能位点可能是未报告的功能变异的tag-SNP。为此，团队下载了千人基因组数据库中的CEU人群rs10516526位点前后500kb的SNP数据进行LD分析（r2≥0.8），找到256个LD SNPs。进一步的，基于ENCODE数据库对该区域的组蛋白标记（H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac）和DNase I超敏区分析，锁定7个候选功能区域的42个LD SNPs进行研究，其中rs80245547在GSTCD基因启动子区（PRE3中），可能直接参与调控GSTCD基因；其余41个SNP位点，可能通过远程互作调控GSTCD基因（图2）。

图2：rs10516526连锁位点及候选调控区域。

    利用双荧光报告分析和细胞水平的基因编辑验证rs80245547对GSTCD基因启动子区域的调控作用，发现rs80245547所在区域具有较强的启动子活性，并且与rs80245547C相比，rs80245547T的启动子活性增加了约19%。而敲除rs80245547附近区域可以显著下调GSTCD基因的表达，说明该位点及其所在区域在调控GSTCD基因表达中具有重要作用（图3）。

图3：启动子rs80245547对GSTCD基因的调控。

    与此同时，采用3C实验确定了其余41个SNPs中，可能远距离调控GSTCD基因表达的SNP（rs72673891和rs59462153）（图4），并通过双荧光报告分析，进一步确定rs72673891以增强子的模式远距离调控GSCTD基因的表达，细胞水平的基因编辑验证说明该位点及其所在区域在调控GSTCD基因表达中具有重要作用（图5）。

图4：与GSTCD基因存在染色质互作的区域。

图5：增强子rs72673891对GSTCD基因的调控。

    3）C-Jun和CREB1是rs80245547和rs72673891调控GSTCD基因所必需的

    为了了解rs80245547和rs72673891是如何调控GSTCD基因的表达，团队首先对rs80245547和rs72673891附近结合的转录因子进行了预测，并通过ChIP-qPCR检测发现两个位点附近均可结合转录因子C-Jun和CREB1（图6）。

图6：rs80245547和rs72673891结合的转录因子检测。

    同时，团队采用RNAi干扰验证了rs80245547和rs72673891通过转录因子影响GSTCD基因的调控。当分别干扰了转录因子C-Jun和CREB1的表达后，GSTCD的表达量显著下调，rs80245547不能调控GSTCD基因基因的表达，rs72673891的增强子调控作用也显著发生改变（图7）。

图7：转录因子C-Jun和CREB1影响rs80245547和rs72673891对GSTCD的调控。

    4）Rs80245547T和rs72673891G对C-Jun和CREB1的结合能力较强

    此外，为进一步了解rs80245547和rs72673891对GSTCD基因表达调控的影响是否是通过影响转录因子的结合效率来实现的，团队采用EMSA实验对不同等位基因型与转录因子C-Jun和CREB1的结合能力差异进行了验证，再一次证实rs80245547和rs72673891附近均可能结合转录因子C-Jun和CREB1，并且rs80245547 T对这两种蛋白的结合能力比rs80245547 C强，rs72673891 G与C-Jun或CREB1结合强于rs72673891 A（图8）。

图8：rs80245547 和rs72673891不同等位基因型与C-Jun和CREB1转录因子结合。

    总结
 

    本研究首次证实了GSTCD是COPD的候选基因，并进一步揭示了双SNP（rs80245547T和rs72673891G）可以通过结合C-Jun和CREB1远程上调GSTCD的表达，从而降低COPD的易感性。这些发现将有助于揭示后GWAS时代基因型-表型与COPD的功能关联。

相关论文信息

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    ▌论文标题：

    Remote regulation of rs80245547 and rs72673891 mediated by transcription factors C-Jun and CREB1 affect GSTCD expression

    ▌论文网址：

    https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)01460-8

    ▌DOI：

    https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.107383